Разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера

Ключевая разница - Максам Гилберт против Сэнгера
 

Нуклеотиды являются основными структурными единицами и строительными блоками ДНК. Молекула ДНК состоит из полинуклеотидной цепи. В ДНК найдено четыре разных нуклеотида. Эти нуклеотиды состоят из четырех различных азотистых оснований, названных A (аденин), G (гуанин), C (цитозин), T (тимин). Порядок нуклеотидов в молекуле ДНК имеет большое значение, поскольку он кодирует важную генетическую информацию для роста и развития организмов. Секвенирование ДНК относится к процессу, который определяет точную нуклеотидную последовательность ДНК. Существуют разные методы секвенирования ДНК. Секвенирование Максама Гилберта и секвенирования ДНК Сангера - два метода секвенирования ДНК, которые относятся к секвенированию первого поколения. Процедура секвенирования Maxam Gilbert определяет последовательность оснований путем химического расщепления 5'-концевых меченых фрагментов ДНК предпочтительно на каждом из четырех нуклеотидов и гель-электрофореза. Процедура секвенирования Сэнгера определяет нуклеотидную последовательность путем синтеза одноцепочечной ДНК с использованием ДНК-полимеразы и дидезоксинуклеотидов и гель-электрофореза. В этом ключевое отличие Maxam Gilbert от Sanger Sequencing.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные отличия
2. Что такое Максам Гилберт
3. Что такое секвенирование Сэнгера
4. Сравнение бок о бок - секвенирование Максама Гилберта и Сангера
5. Резюме

Что такое секвенирование Максама Гилберта?

Максам Гилберт секвенирование, также известный как метод химического секвенирования, это методика, которая была разработана для определения порядка нуклеотидов в ДНК. Этот метод был введен Уолтером Гилбертом и Аланом Максамом в 1976 году и стал популярным, поскольку его можно выполнять непосредственно с очищенной ДНК. Метод Максама Гилберта относится к первому поколению секвенирования ДНК, и это был первый метод секвенирования, широко используемый учеными.

Основной принцип этого метода заключается в ограничении концевых меченых фрагментов ДНК на конкретных основаниях химическими веществами и условиями, специфичными для основания, и разделении меченых фрагментов с помощью электрофореза, как показано на рисунке 01. Фрагменты разделяются в соответствии с их размерами на гель. Поскольку фрагменты помечены, последовательность молекулы ДНК может быть легко выведена.

Метод Максама Гилберта использует специфические химические вещества для разрушения ДНК на определенных основаниях. Два общих химических вещества, называемые диметилсульфатом и гидразином, используются для селективного воздействия на пурины и пиримидины, соответственно..

Метод секвенирования Максама Гилберта выполняется в несколько этапов следующим образом.

1. Очистка последовательности ДНК с использованием эндонуклеаз рестрикции
2. Маркировка концов фрагментов ДНК путем добавления радиоактивных фосфатов
3. Очистка меченых фрагментов от немеченых фрагментов гель-электрофорезом
4. Разделение меченой на концах ДНК на четыре пробирки и обработка основными химическими веществами отдельно
5. Электрофорез содержимого каждой пробирки по отдельным линиям на геле и разделения фрагментов по их длине.
6. Обнаружение фрагментов с помощью авторадиографии.

Рисунок 01: Максам Гилберт Секвенирование

Что такое секвенирование Сэнгера?

Секвенирование Сангера - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сангером и его коллегами в 1977 году для определения последовательности оснований данного фрагмента ДНК. Это также известно как последовательность завершения цепи или Метод дидезокси-секвенирования. Этот метод работает по принципу селективного включения дидезоксинуклеотидов (ddNTP) с концевыми цепями, таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время синтеза одноцепочечной ДНК для прекращения образования цепи. Дидезоксинуклеотиды не имеют 3'-ОН-групп для образования фосфодиэфирных связей с соседним нуклеотидом. Следовательно, образование цепи останавливается, как только ddNTP включается во вновь формирующуюся цепь во время секвенирования sanger..

В этом методе четыре отдельные реакции синтеза ДНК (ПЦР) выполняются в четырех отдельных пробирках с одним типом ддНТФ. Другие требования также предъявляются к пробиркам для ПЦР, включая праймеры, dNTP, Taq-полимеразу, особые условия и т. Д. Четыре отдельные реакции проводят в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакций ПЦР полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют гель-электрофорезом. Затем фрагменты визуализируют, используя меченый (радиоактивный или флуоресцентный) праймер или dNTP, как показано на рисунке 02..

Рисунок 02: Sanger Sequencing

В чем разница между Максамом Гилбертом и Сэнгером?

Максам Гилберт против Сэнгера
Секвенирование Максама Гилберта - первая методика, разработанная для секвенирования ДНК.	Метод секвенирования Сэнгера был введен после метода секвенирования Максама Гилберта.
использование
Этот метод используется редко.	Секвенирование Сэнгера обычно используется для секвенирования.
Использование опасных химических веществ
Он использует опасные химические вещества.	Использование опасных химикатов ограничено по сравнению с методом Максама Гилберта.
Маркировка для обнаружения
Этот метод использует радиоактивный P32 для маркировки концов фрагментов ДНК.	При секвенировании Сэнгера используются радиоактивно или флуоресцентно меченные ddNTP.

Резюме - Максам Гилберт против секвенирования Сангера

Секвенирование Максама Гилберта и Сангера - это два типа техники секвенирования ДНК, относящиеся к секвенированию ДНК первого поколения. Секвенирование Максама Гилберта - это первый метод, предложенный для секвенирования ДНК в 1976 году, и он осуществляется путем разрушения концевых меченых фрагментов ДНК химическими веществами, специфичными для основания. Следовательно, это известно как химическая последовательность. Метод секвенирования Сэнгера был введен в 1977 году и основан на реакциях терминации цепи, управляемой ddNTP. Метод секвенирования Сэнгера более популярен, чем метод Максама Гилберта, из-за нескольких недостатков метода Максама Гилберта, таких как чрезмерное потребление времени, использование опасных химикатов и т. Д. В этом заключается разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера.

Ссылки:
1.Максам, А.М и Уолтер Гилберт. «Новый метод секвенирования ДНК». Труды Национальной академии наук. National Acad Sciences, 9 декабря 1976 года. Веб. 30 марта 2017
2. Хезер, Джеймс М. и Бенджамин Чейн. «Последовательность секвенсоров: история секвенирования ДНК». Genomics. Academic Press, январь 2016 г. Интернет. 30 марта 2017
3.Парик, Чандра Шехар, Рафал Смочинский и Анджей Третьин. «Технологии секвенирования и секвенирования генома». Журнал прикладной генетики. Springer-Verlag, ноябрь 2011 г. Интернет. 30 марта 2017

Изображение предоставлено:
1. «Последовательность Максама Гилберта» несколько раз в английской Википедии (CC BY 3.0) через Commons Wikimedia
2. «Sanger-sequencing» Эстевеж - Собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia