Разница между секвенированием Sanger и пиросеквенированием

Ключевая разница - секвенирование Сэнгера против пиросеквенирования
 

Секвенирование ДНК очень важно для анализа ДНК, поскольку знание правильного расположения нуклеотидов в конкретной области ДНК позволяет получить много важной информации о ней. Существуют разные методы секвенирования ДНК. Секвенирование Сэнгера и пиросеквенирование - два различных метода секвенирования ДНК, широко используемые в молекулярной биологии. Основное различие между секвенированием Сангера и пиросеквенированием заключается в том, что Секвенирование Сэнгера использует дидезоксинуклеотиды для прекращения синтеза ДНК для считывания нуклеотидной последовательности, в то время как пиросеквенирование обнаруживает высвобождение пирофосфата путем включения нуклеотидов и синтеза комплементарной последовательности для считывания точного порядка последовательности.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные отличия
2. Что такое Sanger Sequencing
3. Что такое пиросеквенирование
4. Сравнение бок о бок - секвенирование Сэнгера и пиросеквенирование
5. Резюме

Что такое секвенирование Сэнгера?

Секвенирование Сангера - это метод секвенирования ДНК первого поколения, разработанный Фредериком Сангером и его коллегами в 1977 году. Он также известен как Последовательность завершения цепи или Дидезокси секвенирование поскольку он основан на терминации цепи дидезоксинуклеотидами (ddNTP). Этот метод широко использовался в течение более 30 лет, пока не была разработана последовательность нового поколения (NGS). Техника секвенирования Сэнгера позволила обнаружить правильный порядок нуклеотидов или присоединение определенного фрагмента ДНК. Он основан на селективном включении ддНТФ и прекращении синтеза ДНК во время в пробирке Репликация ДНК. Отсутствие 3'-ОН-групп для продолжения образования фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами является уникальной особенностью ддНТФ. Следовательно, как только ddNTP присоединен, удлинение цепи прекращается и заканчивается с этой точки. Существует четыре ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP - используемые в секвенировании Sanger. Эти нуклеотиды останавливают процесс репликации ДНК, когда они включаются в растущую цепь ДНК и приводят к различной длине короткой ДНК. Капиллярный гель-электрофорез используется для организации этих коротких нитей ДНК по размеру на геле, как показано на рисунке 01.

Рисунок 1: Капиллярный гель-электрофорез синтезированной короткой ДНК

За в пробирке репликация ДНК, некоторые требования должны быть предоставлены. Это ДНК-полимеразный фермент, матричная ДНК, олигонуклеотидные праймеры и дезоксинуклеотиды (dNTP). При секвенировании по Сэнгеру репликация ДНК выполняется в четырех отдельных пробирках вместе с четырьмя типами ddNTPs по отдельности. Дезоксинуклеотиды не полностью заменены соответствующими ddNTP. Смесь конкретного dNTP (например, dATP + ddATP) включается в пробирку и реплицируется. Четыре отдельных продукта пробирки наносят на гель в четырех отдельных лунках. Затем, читая гель, можно построить последовательность, как показано на рисунке 02.

Рисунок 02: Sanger секвенирование

Секвенирование Сэнгера является важной техникой, которая помогает во многих областях молекулярной биологии. Проект генома человека был успешно завершен с помощью методов секвенирования Сангера. Секвенирование Сэнгера также полезно при секвенировании ДНК-мишени, исследованиях рака и генетических заболеваний, анализе экспрессии генов, идентификации людей, обнаружении патогенов, микробном секвенировании и т. Д..

Есть несколько недостатков секвенирования Sanger:

• Длина секвенируемой ДНК не может превышать 1000 пар оснований.
• Только одна нить может быть секвенирована за один раз.
• Процесс трудоемкий и дорогой.

Поэтому со временем были разработаны новые передовые методы секвенирования для преодоления этих проблем. Однако секвенирование Сэнгера все еще используется из-за его очень точных результатов до приблизительно 850 фрагментов длины пары оснований.

Что такое пиросеквенирование?

Пиросеквенирование является новой техникой секвенирования ДНК, основанной на «секвенировании по синтезу». Этот метод основан на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотидов. В этом процессе участвуют четыре различных фермента: ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза и два субстрата: аденозин-5 'фосфосульфат (APS) и люциферин..

Процесс начинается со связывания праймера с одноцепочечной ДНК-матрицей, а ДНК-полимераза начинает включение нуклеотидов, комплементарных ей. Когда нуклеотиды объединяются (полимеризация нуклеиновой кислоты), он высвобождает пирофосфатные (две связанные фосфатные группы) группы и энергию. Каждое добавление нуклеотидов высвобождает эквимолярное количество пирофосфата. Пирофосфат превращается в АТФ с помощью АТФ-сульфурилазы в присутствии субстрата АФС. Генерируемая АТФ стимулирует люциферазопосредованное превращение люциферина в оксилюциферин, производя видимый свет в количествах, которые пропорциональны количеству АТФ. Свет обнаруживается устройством обнаружения фотонов или фотоумножителем и создает пирограмму. Апираза разлагает АТФ и не включенные дНТФ в реакционной смеси. Добавление dNTP выполняется по одному за раз. Поскольку добавление нуклеотида известно по включению и обнаружению света, можно определить последовательность матрицы. Пирограмма используется для генерации нуклеотидной последовательности образца ДНК, как показано на рисунке 03.

Пиросеквенирование очень важно для анализа полиморфизма отдельных нуклеотидов и секвенирования коротких участков ДНК. Высокая точность, гибкость, простота автоматизации и параллельная обработка - преимущества пиросеквенирования по сравнению с методами секвенирования Sanger.

Рисунок 03: Пиросеквенирование

В чем разница между секвенированием Sanger и пиросеквенированием?

Sanger Sequencing против пиросеквенирования
Секвенирование Сэнгера - это метод секвенирования ДНК, основанный на селективном включении ddNTP с помощью ДНК-полимеразы и обрыва цепи..	Пиросеквенирование представляет собой метод секвенирования ДНК, основанный на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотида..
Использование ddNTP
дДНТФ используются для прекращения репликации ДНК	ddNTP не используются.
Ферменты участвуют
ДНК-полимераза используются.	Используются четыре фермента: ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза..
Используемые субстраты
АПС и Люциферин не используются.	Аденозин 5 'фосфосульфат (APS) и люциферин используются.
Максимальная температура
Это медленный процесс.	Это быстрый процесс.

Резюме - секвенирование Сэнгера против пиросеквенирования

Секвенирование Сэнгера и пиросеквенирование - два метода секвенирования ДНК, используемые в молекулярной биологии. Секвенирование Сэнгера строит порядок нуклеотидов в последовательности путем прекращения удлинения цепи, в то время как пиросеквенирование строит точный порядок нуклеотидов в последовательности путем включения нуклеотидов и обнаружения высвобождения пирофосфатов. Следовательно, основное различие между секвенированием Сэнгера и пиросеквенированием заключается в том, что секвенирование Сэнгера работает над секвенированием по окончанию цепи, а пиросеквенирование работает с секвенированием с помощью синтеза.

Ссылка:
1. Факруддин М.Д. и Абхиджит Чоудхури. «Пиросеквенирование - альтернатива традиционному секвенированию». Американский журнал биохимии и биотехнологии. Science Publications, 02 марта 2012 г. Интернет. 28 февраля 2017.
2. «Секвенирование Сэнгера». Секвенирование Сэнгера - ScienceDirect Topics. Н.п., н.д. Web. 28 февраля 2017

Изображение предоставлено:
1. «Дидезокси-метод». Кристоф Гоманс (modifiziert) - д-р Норман Маудер, профессор Бас-Эйнер Дейти фон Кристоф Гоманс (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia
2. «Sanger-DNA-seq» Энцо из польской языковой Википедии (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia
3. «Пиросеквенирование» микробиологическими байтами (CC BY-SA 2.0) через Flickr